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水中葉綠素a—螢光光度檢測法

摘要

水中葉綠素a檢測可以評估湖泊水庫優氧化及海水水域生產力,為生態環境評估的檢測技術之一。水中葉綠素a檢測程序中包括過濾水樣、濾紙保存、萃取溶劑、萃取方式及分析方法等步驟,需加以規範,以確切求得真實樣品濃度,本實驗針對美國環保署445公告的葉綠素螢光測定法的實驗流程逐一探討比較萃取溶劑、研磨技術、水樣保存方式、濾紙保存方式、萃取時間與不同儀器分析結果。發現不同的萃取溶劑萃取效益不同,應與萃取方式配合。以丙酮溶劑萃取葉綠素時,濃度90%優於100%,且須配合將濾紙剪碎再加以研磨。以高嶺土造成的濁度並不影響葉綠素a以螢光光度計分析。試驗進行過程中應盡量避光,因為光會破壞葉綠素a。濾紙保存於-196℃環境下會提高其萃取效率應重新進行驗證工作。

關鍵字:葉綠素a、優養化、玻璃纖維濾紙、萃取溶劑

一、前言:

                                          光照

圖解圖示 6CO2 + 6H2O                                           C6H12O6 + 6O2

                                                        葉綠素

具有葉綠素的植物吸收二氧化碳與水,在光照下轉換為有機物及氧氣。這些植物不僅分布在陸地上,水域中可見光區內也充滿固著、飄浮及浮游植物。浮游植物生物量雖然僅佔所有植物量1 ﹪,卻負起植物總產能的一半。這些有效率的植物將大量二氧化碳轉換為有機質,提供給浮游性動物作為食物,蝦攝食浮游動物,小魚吃蝦,大魚吃小魚,提高區域生態產能。因此水域中,透過浮游植物量常可瞭解該水域的生產力。此外,湖泊水庫中常發生優養化的現象,優養化過程中浮游植物常過量繁殖,監控湖泊水庫浮游植物量亦為目前環境管理一課題。

實際上葉綠素(chlorophyll)本身不單指一種分子,葉綠素家族包含有葉綠素 a、b、c和d。葉綠素a和b的分子結構是由像環一樣的結構-比咯紫質(porphyrin),和一長的有機"phytol"尾巴。在比咯紫質環的中心是一個鎂分子(圖 一)。葉綠素c缺乏phytol鏈。依藻類種類不同(圖二),這些葉綠素在細胞內的比率而不同。葉綠素d只有在海水中的紅色藻類才發現,而葉綠素b和c通常存在於淡水水域藻類中。所有的植物細胞中均可發現葉綠素a,因此分析葉綠素a可以推估植物體生物量甚至可以初步了解該區域的生產力。 在1930年代末期成功地從高等植物中純化及結晶出葉綠素a,葉綠素才成為評估浮游植物生物量的的工具。

量測葉綠素a有分光光度計法、螢光光度計法及高效能液相層析儀等方法。其中螢光光度計比分光光度計靈敏,所需樣品量也較少、也可進行活體的量測,但是由於其它色素或葉綠素降解的產物螢光吸收光譜與葉綠素有重疊,常造成高估或低估葉綠素a的含量。Pheophorbide a 及 pheophytin a 為葉綠素a降解常見的兩種色素,因其吸收螢光光譜與葉綠素a重疊,造成以螢光光度計量測葉綠素a時干擾。高效能液相層析儀能定量光合色素-葉綠素a、附屬色素-葉綠素b、c及葉綠素降解產物-chlorophyllides、pheopheophytins、pheophytins,可進一步瞭解浮游植物群聚的組成。

除了活體直接量測外,分析葉綠素a的第一步驟為過濾。Herve and Heinomen (1982)認為水體儲存在4℃黑暗中可保存一天而不至於使葉綠素明顯降解,Weber et al.(1986)發現樣品在冰箱中放置18天並無明顯變化,但在室溫下5天就降解50%。研究者認為葉綠素a對光線與溫度相當敏感,水質的酸度會加速其降解,加上水中浮游動物攝食浮游植物,分析葉綠素a時建議立即過濾水體。

過濾時的濾紙種類不下百種,大致區分為兩大類:一為玻璃纖維濾紙類(glass-fiber)或深度濾紙(depth filters),透過纖維將過濾的顆粒保留在濾紙表面及內部;另一類為膜濾紙(membrance filters)或表面濾紙(surface filters),將粒徑大於濾紙孔徑的顆粒全部留在濾紙表面,材質包括cellulose-acrtate、nitrate esters、polycarbonate、polyester、polysulfone、nylon、polyetrafluorethylene Teflon polymers、inorganic filters等。目前葉綠素a分析大多採用玻璃纖維濾紙,主要是因:

1.      具較大的過濾容量。

2.      較快的過濾速度,濾紙不會太快被阻塞。

3.      不與有機溶劑作用,但是膜類濾紙會溶解在丙酮、甲醇、 dimethylformamide ,經離心後,會有混濁物或殘渣,進行高效能液相層析儀分析會造成阻塞管柱,還有一些膜類濾紙如nuclepore polycarbonate會與溶劑作用而呈色反應,影響分析。

4.      灰化後僅成為C、N、H元素。

5.      研磨萃取時幫助破壞細胞。

6.      價格較便宜。

但是玻璃纖維濾紙的孔徑不像膜類濾紙那麼精細與一致,僅能提供平均孔徑如Whatman GF/F平均孔徑為0.7μm、GF/C為1.2μm、Gelman A/E為1 μm,一般僅能捕捉顆粒達98﹪效率,較小細胞未能保留在濾紙上,造成量測色素明顯偏差。為降低過濾時所造成誤差,美國環保署公告葉綠素a檢測方法就規定過濾時過濾幫浦壓力不得超過6 in Hg (即152.4 mm Hg )。

過濾水樣後的濾紙,經避光處理(如包裹在錫箔紙或不光的保存盒等),可依保存的方式不同保存時間長短而不一。

(一)  保存在-196℃(液態氮)中

曾有此保存試驗進行328天後發現仍有96﹪高回收率,但需注意以甲醇或DMF萃取時,液態氮可能促使其他色素產生。

(二) 保存在-90℃(超低溫冷凍)中

保存60天回收濾可高達110﹪,降解最多不超過6 mole ﹪chlorophyll a,固態二氧化碳(-78℃)容器為此類常見攜帶型的工具。

(三) 保存在-20℃(冷凍庫)中

保存一不超過一星期回收率大於95﹪,而葉綠素a降解程度降至最低。

(四) 冷凍乾燥後,保存在+22℃中

冷凍乾燥造成大量損失而且葉綠素廣泛降解,而葉黃素在1天內降低25﹪,328天減少80﹪。所以並不推薦用此保存方式。

從細胞中萃取出色素要比一般”溶劑-溶質”作用來得複雜,溶劑首先需穿透細胞壁,溶解色素體膜上的脂肪及脂蛋白,萃取的效率主要取決於能對抗細胞壁、溶劑的穿透及溶解特性、萃取所需時間、其他可能干擾的機制等。不同藻類細胞壁成份不同,如具有盔甲的窩鞭毛藻類、含矽的矽藻、厚壁的綠藻及多醣體細胞壁的藍藻,使得因試驗目地、對象,所使用溶劑與萃取方式而改變。萃取技術所需考量為:

(一) 萃取能力:所有的色素需能完全從浮游藻類中萃取出。

(二)  忠實度:能萃取出色素,但不會造成產物變化,需避免葉綠素酵素(chlorophyllase enzymes)活化,de-metallation、allomerization、epimerization of chlorophylls and degradation or isomerization of the carotenoids,使用低溫中性萃取溶劑在黑暗中快速進行可降低色素降解,當然所萃取出的色素能穩定存在該溶劑中,直至測量。

(三)  可匹配:如果樣本最後以高效能液相層析儀分析,就需考量溶劑是否適合該分析系統。

(四)  精確度:重覆分析能達高精確度。

(五)  簡單化:操作過程簡單、步驟少、在野外能大量且快速處理。

(六) 安全:溶劑需低毒性、低自燃力,很多溶劑可溶解脂溶性色素,容易造成皮膚的腐蝕,需避免直接接觸。儘量減少溶劑轉換及用手去操作浸泡過溶劑的濾紙,在海上作業不比實驗室環境佳,安全考量應為首要。

萃取的方式主要有三種各有其優缺點:

(一)  浸泡

這為最常用的萃取方式,操作最簡單,最能處理大量樣本。但浸泡法所需萃取時間因萃取溶劑及萃取條件不同而長短不一,dimethylsulphoxide 在65℃下需10分鐘;90﹪丙酮需隔夜;其他溶劑在4℃下可能約需40小時。但儲存這些具自燃性、揮發性、閃點又低(丙酮-17℃)在冰箱中,需有安全上的考量。

(二)  研磨

以馬達驅動鐵夫龍旋轉杵500rpm旋轉速度,在玻璃均質管中將藻細胞破壞,並且讓溶劑穿透,若鐵夫龍旋轉杵與均質管不夠密合,影響萃取效率,若太密合造成濾紙在夾縫中降低旋轉速度,有時會造成過熱,此外研磨後的泥物需轉至離心管中,將萃取液與濾紙碎片等雜質以離心方式分離,這是眾所皆知最易造成分析上損失的操作與接觸溶劑的風險。為避免操作的失誤以致玻璃均質管破裂,玻璃四散,操作過程中需眼睛與手的防護。

(三)                  超音波

在溶劑中超音波形成或瓦解細胞孔穴進而破壞細胞。幾微米的區間壓力可達20000大氣壓,溫度達10000℃,10分鐘的萃取常會導致溶劑過熱及色素降解,而操作過程中最好有隔音裝置或耳塞。

萃取時所選擇的溶劑需配合萃取方法與目的而有不同的考慮因素,以下逐一介紹常應用於萃取葉綠素溶劑的特性:

1、 丙酮 (溶點-94℃、沸點56℃、閃點-17℃)

曾有報告指出萃取海洋藻類以90%丙酮浸泡9小時,萃取效果佳,因為葉綠素酵素隨著溶劑中水含量愈高,活性增加,所以有學者建議先用100%丙酮萃取再析釋至90%以分光光度計分析。在安全考量下,丙酮最大問題為具高自燃性。

2、 甲醇 (溶點-98℃、沸點65℃、閃點12℃)

在萃取許多綠藻試驗中,甲醇比90%丙酮效率高,Sartory and Grobbelaar (1984) 提出以甲醇作為萃取葉綠素溶劑,可以不需研磨。但是有報告指出,色素在甲醇中比在丙酮中不穩定,在甲醇中容易產生allomerization,約有1.5﹪葉綠素a轉換形成chlorophyllides、allomers、epimers,當 chlorophyllase活性甲醇中持續存在,就會形成methyl chlorophylides。故有研究建議使用緩衝的甲醇¾98﹪methanol + 2﹪ammonium acetate。

3、 Dimethyl sulphoxide (DMSO, 溶點18.6℃、沸點189℃、閃點88℃)

Dimethyl sulphoxide是一種很強穿透性試劑,通常單獨使用或與丙酮共用。以Dimethyl sulphoxide或90﹪丙酮可萃取等量藍藻或矽藻,但是Dimethyl sulphoxide萃取綠藻效率為90﹪丙酮2至60倍,而萃取厚壁綠藻則以Dimethyl sulphoxide/acetone混合液優於丙酮單獨使用。

4、 Dimethyl formamide (DMF,溶點-61℃、沸點153℃、閃點57℃)

萃取高等植物的葉綠素時Dimethyl formamide比80﹪丙酮佳,而且不需研磨,而測海水樣品則優於90﹪丙酮,也不需研磨,且葉綠素a在Dimethyl formamide很穩定,萃取後在黑暗中4℃下可保存30天,比丙酮或乙醇自燃性低,揮發性低,但此溶劑具毒性。

5、 Ethanol (乙醇,溶點-130℃、沸點78℃、閃點13℃)

最安全的萃取溶劑,常應用在淡水浮游藻類,海水藻類則較少;萃取效率與甲醇相近,Sartory and Grobbelaar (1984) 指出乙醇與甲醇同,萃取時可以不需研磨。當乙醇濃度降至83﹪,萃取效率降低10-25﹪。

6、 Chloroform-methanol (2:1 v/v)

脂溶性溶劑,萃取效率比DMSO、甲醇、丙酮等溶劑高。

分析水中葉綠素的含量的儀器目前主要有三種分光光度計、螢光光度計與高效能液體層析儀:

1.分光光度計:分光光度計分析法是在1930至1940間所發展出來的,據記載最早以分光光度計同時可分析浮游植物萃取液葉綠素a、b及c為1952年Richards and Thompson,但因葉綠素a降解的產物沒有扣除、所使用的萃取係數過低,高估葉綠素a的測值。Richards and Thompson研發三色技術(trichromatic technique)同時可測葉綠素a、b、c三種色素的技術。以三色經驗方程式(trichrmatic equations)中將葉綠素在最大的吸收波長減掉其他種葉綠素的干擾。Parsons and Sreickland、UNESCO、Jeffrey and Humphrey分別在1963、1966、1975年提出更精確的萃取係數,都能精確地評估葉綠素a,僅Jeffrey and Humphrey(1975)所提的係數亦能精確評估葉綠素b及c。美國環保署公告446方法是採用Jeffrey and Humphrey (1975)的修正方程式

CE,a=11.85 (Abs 664)-1.54 (Abs 647)-0.08 (Abs 630)

CE,b=21.03 (Abs 647)-5.43 (Abs 664)-2.66 (Abs 630)

CE,c=24.52 (Abs 630)-7.60 (Abs 647)-1.67 (Abs 664)

其中CE,a表萃取液中葉綠素a的濃度(mg/L),CE,b表萃取液中葉綠素b的濃度(mg/L),CE,c表萃取液中葉綠素c1+c2的濃度(mg/L)。

最後校正回原水樣中葉綠素含量方程式:

Cs=   CE,(a,b,or c) X 萃取液體積(L) X稀釋因子      

CE,a=26.7 (Abs 664b-Abs 665a)

PE,b=26.7〔1.7 X (Abs 665a)- (Abs 664b)〕

CE,a表萃取液中葉綠素a的濃度(mg/L);PE,a表萃取液中Pheophytin a的濃度(mg/L);Abs 664b表樣本酸化前在波長664nm的吸光值(減去波長750nm吸光值後);Abs 665a表樣本酸化後在波長665nm的吸光值(減去波長750nm吸光值後)。

螢光光度計分析法是Holm-Hansen et al. 在1965所發展出來的。當葉綠素分子暴露在藍光下,會在光譜的紅光區發螢光。它的敏感度為分光光度計的50倍,這可使過濾的水樣遠低於分光光度計所使用的量。Loftus and Carpenter 1971也研發出多色素螢光方程式(multi-chromatic fluorescence equations)。除了敏感度,很少人論及螢光光度計超越分光光度計,這是因為螢光光度計的衰減係數及每次的校正均需依賴分光光度計。Weber et al. (1986)提出b-胡蘿蔔素(b-carotene)及其他色素會降低葉綠素a所發出的螢光,過高濃度的葉綠素含量也會降低螢光。Marker et al. (1980)並不建議以螢光光度計分析淡水酸化水樣,因為葉綠素b經酸化後所產生的phaeophytin發出的螢光與phaeophytin a光譜重疊會高估phaeo-pigments。目前有些儀器商逐漸改進螢光光度計特別窄的帶通(bandpass)激光(excitation)及發散(emission)濾光器,可免去酸化的校正動作。

高液相氣體層析儀是在1970年代末期1980年代初期作為研究高等植物色素所使用。它可以完全分離葉綠素a、b、c3、c1+c2+Mg3、pheophorbide a、pheophytina、pheophytin b及葉綠素a的allomer,還可以分離超過30種的胡蘿蔔素等。它的定量方法包括檢量線與樣品內添加方式,惟操作過程需有經驗人員及費時較長。

美國環保署公告445的螢光光度分析法(In Vitro Determination of Chlorophyll a and Pheophytin a in Marine and Freshwater Algae by Fluresence)步驟為:

首先先確定所有採樣器具需無殘留酸化的物質,取定量的水樣體積(依水樣的顆粒多寡而定,過濾後濾紙需呈現淡綠或褐色(外海常需過濾達四公升水樣,因浮游植物較稀少;內陸或湖泊則可降低至一公升以下),以低壓(不超過6 in Hg 即20 KPa)抽氣幫浦過濾(時間不得超過10分鐘,否則容易破壞細胞降低葉綠素測值)至玻璃纖維濾紙上,但是不要使用幫埔將濾紙上水樣完全抽乾。

以鑷子將濾紙移離開過濾器,將之摺疊,含有顆粒物質的那面在內側,用吸紙輕輕吸取濾紙上過多的水分,將濾紙放在培養皿 (petri dish) 或其他適合的容器內,若不立即進行萃取,用鋁箔紙將容器包裹以避光,儲存於-20℃或-70℃的冰箱中,若儲存於冰塊中,2至4小時內仍可行,於-20℃的環境下儲存不得超過31/2星期。

萃取過程中,為方便萃取,將濾紙浸泡在90%丙酮冰箱內2小時以上,但不超過24小時,將濾紙移出冰箱,置於黑暗處回溫。將均質機組合好,含水、含丙酮的洗滌瓶準備在側,工作平台上的光線盡可能調暗。將濾紙自容器中取出,剪成小片狀,放入玻璃研磨管內,以玻棒將之推至研磨管底,加入4 mL 90%丙酮(丙酮:水= 9:1),以500 rpm研磨1分鐘,將濾紙片研磨成泥,需注意研磨過程不可過熱。將濾紙泥移入15 mL具螺旋蓋的離心管,再用6 mL的90%丙酮(丙酮:水= 9:1),清洗附在旋轉杵、及管內的殘留物,此清洗液也注入含濾紙泥的離心管內,蓋上螺旋蓋,震盪之,將之置於黑暗,直到進行下ㄧ步驟。研磨下一張濾紙前,用丙酮、用水清洗旋轉杵、研磨管及玻棒,為降低試劑級的溶劑使用,可先用水龍頭水清洗後,再用丙酮潤濕;空白試驗的濾紙留至最後研磨。以675g離心15分鐘或1000g 離心5分鐘。取其上澄液。

螢光光度計須依賴分光光度計校正,故校正與檢量線的製作不同,而套用的方程式也不一樣。

校正:每兩個月需作校正一次,或儀器剛調整過如更換燈泡、濾光器、光電倍增器,以稀釋的標準儲存液配製0.2、2、5、20及200 μg chl a/L,至少暖機15分鐘,於設定儀器敏感度下讀取其螢光光度值,

Fs=Ca/Rs

F= 敏感度設定在s的反應因子

Ca = 在敏感設定在s的螢光光度值

Rs = 葉綠素a的濃度

若使用特殊帶通的濾光器則不需進行酸化處理

r=Rb/Ra

Ra =酸化前葉綠素a標準溶液的螢光光度值

Rb =酸化後葉綠素a標準溶液的螢光光度值

r=酸化前後葉綠素a標準溶液的螢光光度值的比值

螢光光度數值的換算

無須校正的葉綠素a換算模式

CE,u=Rb x Fs

本研究將逐一針對水中葉綠素a檢測方法可能造成的影響加以分析討論:

(一)                  比較不同萃取溶劑的萃取效率

(二)                  研磨是否提高其萃取效率

(三)                  濾紙先剪碎與否是否有助於提高萃取效率

(四)                  濁度的影響

(五)                  試驗過程中光照會不會造成影響

(六)                  水樣保存與保存溫度對葉綠素a檢測的影響

(七)                  萃取時間對葉綠素a檢測的影響

(八)                  保存時間與方式對葉綠素a檢測的影響

二、材料與方法

(一)                  螢光儀:Turner Designs Model 10 AU或同級品激光波長440 nm,放射光波長665m。

(二)                  分光光度計:Hitach U3000。

(三)                   分析天平: 能經稱至0.1 mg。

(四)                  離心機: 可達1,500 g以上。

(五)                  濾片: 玻璃纖維濾片(直徑47 mm),Whatman GF/F或同級品,孔徑約0.8mm。    

(六)                  真空抽氣裝置。

(七)                  水樣容器: 500 或1000 mL。

(八)                  夾子或先端扁平的鑷子。

(九)                  恆溫箱(可維持在60±1oC)。

(十)                    冰箱。

(十一)             鋁箔紙。

(十二)             量筒: 50 或100 mL。

(十三)             定量吸管: 5 或10 mL。

(十四)             溫度計。

(十五)             丙酮,100%,分析級。

(十六)             HCl,

(十七)             葉綠素a標準品:購自sigma 。

(十八)             試劑水: 離子交換水或蒸餾水。 

(十九)             90%丙酮溶液: 取100 mL的飽和碳酸鎂溶液,加900 mL 丙酮,定量到1 公升,混合均勻,標示後貯藏待用。

(二十)              葉綠素標準溶液: 將購得之葉綠素a標準品,在弱光下小心地稱取標準品重量1 mg,以90%丙酮溶液溶解之,最後定容至100 mL,使標準溶液濃度為10 mg/L,用鋁箔紙包覆瓶子以避免見光。標準溶液存放於-20oC中,可以保持達數月,但是每一次使用標準溶液時,必須用分光光度計測定,以確認標準溶 液的真實濃度。

三、實驗步驟:

首先先確定所有採樣器具需無殘留酸化的物質,取10至20 L的水樣至儲存器內,移置實驗室,充分混合,取定量的水樣體積(依水樣的顆粒多寡而定,過濾後濾紙需呈現淡綠或褐色,以低壓(不超過6 in Hg 即20 KPa)抽氣幫浦過濾(時間不得超過10分鐘,否則容易破壞細胞降低葉綠素測值)至玻璃纖維濾紙上,但是不要使用幫浦將濾紙上水樣完全抽乾。

以鑷子將濾紙移離開過濾器,將之摺疊,含有顆粒物質的那面在內側,用吸紙輕輕吸取濾紙上過多的水分,將濾紙放在培養皿 (petri dish) 或其他適合的容器內,若不立即進行萃取,用鋁箔紙將容器包裹以避光。

(一)                   比較不同萃取液的萃取效率

將過濾好的濾紙分別至於離心管中分為四組,分別加入甲醇、乙醇、100%丙酮及90%丙酮10 mL,7重覆,室溫浸泡2小時,每30分鐘取出震盪之,以3000g離心15分鐘,倒取上澄液,上螢光光度計分析。

(二)                    研磨是否提高其萃取效率

過濾20個同一水體樣品,將濾紙剪成小片狀,放入玻璃研磨管內,以玻棒將之推至研磨管底,均加入90%丙酮10 mL,萃取過程中,為方便萃取,將濾紙浸泡在90%丙酮冰箱內2小時,將濾紙移出冰箱(4℃),置於黑暗處回溫。將均質機組合好,含水、含丙酮的洗滌瓶準備在側,工作平台上的光線盡可能調暗。加入4 mL 90%丙酮(丙酮:水= 9:1),以500 rpm研磨1分鐘,將濾紙片研磨成泥,需注意研磨過程不可過熱。將濾紙泥移入15 mL具螺旋蓋的離心管,再用6 mL的90%丙酮(丙酮:水= 9:1),清洗附在旋轉杵、及管內的殘留物,此清洗液也注入含濾紙泥的離心管內,蓋上螺旋蓋,震盪之,將之置於黑暗,直到進行下ㄧ步驟。研磨下一張濾紙前,用丙酮、用水清洗旋轉杵、研磨管及玻棒,為降低試劑級的溶劑使用,可先用水龍頭水清洗後,再用丙酮潤濕;空白試驗的濾紙留至最後研磨。以1000g 離心5分鐘。取其上澄液。10個樣品經過研磨,另10個則否,上螢光光度計分析。

(三)                     濾紙先剪碎與否是否有助於提高萃取效率

過濾20個同一水體樣品,其中10個濾紙於研磨前以剪刀剪碎,另10個則否,均分別加入90%丙酮10 mL,研磨後,浸泡2小時後,以3000g離心15分鐘倒取上澄液,上螢光光度計分析。

(四)                     濁度的影響

將同一水體12個水樣分別加入0、0.2、1、3g,的高嶺土,3重覆,混合均勻後過濾,將濾紙剪碎研磨浸泡再離心,取上澄液,上螢光光度計分析。

(五)                     試驗過程中光照會不會造成影響

將同一水體混合均勻過濾14個樣品,濾紙剪碎研磨浸泡再離心,取上澄液,其中7個水樣上澄液照光10分鐘,另7個則處於暗室,上螢光光度計分析。

(六)                     水樣保存與保存溫度對葉綠素a檢測的影響

水樣混合均勻後過濾3個樣品後,隨即將水樣分別保存於25℃與4℃下,經30分鐘、1、2、4、8、24小時後分別取3個樣品,濾紙精簡萃研磨浸泡離心後,取上澄液進行螢光分析。

(七)                     萃取時間對葉綠素a檢測的影響

同一水體混合均勻,過濾18個樣品,經剪碎加入90%丙酮研磨後,至於4℃環境下,經0、1、2、4、16、24小時及3天,分別取3個樣品經離心,取上澄液進行分析。

(八)                     保存時間與方式對葉綠素a檢測的影響

同一水體水樣混合均勻,過濾42個樣品,過濾完後取2個樣品立即進行葉綠素a的檢測,其餘40個濾紙分別包上錫箔紙以避光,於25℃、4℃、-20℃及-196℃環境下分別放置10個上述濾紙,經2、4小時、1、3、7天後,每次每種環境取2個濾紙進行分析。

四、結果

(一)                     比較不同萃取液的萃取效率

以甲醇、乙醇、100%丙酮及90%丙酮浸泡萃取同一混合均勻的水體各七次,以甲醇及以純粹取的水樣所得濃度分別為13.8 與 13.6 ppb,以100%與90%丙酮萃取分別為10.1與10.5 ppb,以甲醇與乙醇萃取效率並無顯著差異(p>0.05),不同濃度丙酮萃取效率亦無明顯差異,但是甲醇與以純粹取效率明顯高於丙酮。

(二)                     研磨是否提高其萃取效率

以90%丙酮萃取同一水體20個樣品,10個樣品經過研磨,另外10個則否,結果經研磨樣品測值為12.4 ppb,沒有研磨樣品平均值為6.4 ppb有明顯差異(p<0.05),研磨可以提高萃取效率。

(三)                     濾紙先剪碎與否是否有助於提高萃取效率

過濾同一水體20個樣品,其中10個樣品的濾紙於研磨前事先以剪刀剪碎,另外10個則否,結果經檢測試先檢碎濾紙的樣品測值平均為29.1 ppb,沒有剪碎樣品平均值為20.8 ppb有明顯差異(p<0.05),剪碎濾紙可以提高研磨萃取效率。

(四)                     濁度的影響

將100 mL水樣分別加入0、0.2、1、3 g的高嶺土,各三重覆,混合均勻後過濾,將濾紙剪碎研磨再離心,最後進行檢測,其平均值分別為31.5、32.1、30.4、31.5 ppb並無顯著差異(p>0.05),可見以高嶺土造成的渾濁並不會影響葉綠素a的檢測。

(五)                     試驗過程中光照會不會造成影響

經研磨、離心後的澄清萃取液,分為二組,每組7個樣品,一組照光10分鐘後上機檢測,另一組則在暗處,光照組的平均值為31.9 ppb,處於暗處者為40.3 ppb,有顯著差異(p<0.05),光照會破壞葉綠素a,試驗進行過程中應盡量避光。

(六)                     水樣保存與保存溫度對葉綠素a檢測的影響

水樣混合均勻後立即過濾3個樣品後,分別保存於25℃與4℃下30分鐘、1、2、4、8、24小時後分別過濾,三重覆,結果如圖三所示,除了第4小時測值稍微下降其餘均與立即過濾的測值並無明顯變化(p>0.05)。

(七)                     萃取時間對葉綠素a檢測的影響

水樣經過濾後,濾紙經研磨萃取後至於4℃環境下,經0、1、2、4、16小時及3天,取出離心上機分析,立即分析、1、2小時後分析結果並無明顯差異(p>0.05)(如圖四所示),4小時後分析的結果有明顯增高之趨勢,第3天的分析測值比第16小時測值略低。

(八)                     保存時間與方式對葉綠素a檢測的影響

將水樣立即過濾後,濾紙以錫箔紙包裹後,分別保存於25℃、4℃、-20℃與-196℃的環境下,於2、4小時、1、3及7天後分別取出二樣品,分析結果如圖五所示。於-196℃環境保存的濾紙樣品分析值均高於其他環境所保存,而且不會因保存時間長短而變化;保存於25℃、4℃及-20℃的濾紙樣品分析值均隨著保存時間增長而增加,尤以-20℃增加最為明顯。

五、討論

(一)                     比較不同萃取液的萃取效率

以甲醇、乙醇、100%丙酮及90%丙酮浸泡萃取,甲醇與乙醇萃取效率並無顯著差異(p>0.05),100%與90%丙酮萃取效率亦無明顯差異,但是100%丙酮萃取取過程中容易造成萃取液白濁現象,造成分光光度計Abs750測值上升,但結果並無顯著影響,與90%丙酮萃取結果相近,就丙酮而言,90%丙酮萃取應優於以100%萃取。甲醇與乙醇萃取效率明顯高於丙酮,主要是因為醇類溶劑容易穿透細胞,破壞細胞,達到萃取效果,但是甲醇具有毒性,屬毒性化學物質的一種,應盡量避免使用。

(二)                     研磨是否提高其萃取效率

研磨過的濾紙在萃取過程中較能將細胞中的葉綠素萃取出,主要植物系浮游生物種類繁多,不乏具有堅固細胞壁藻類,經研磨可提高葉綠素的萃取效能,氮研磨過程中必須預防研磨過程不宜過熱,因為葉綠素a對溫度敏感,過熱容易降解。

(三)                     濾紙先剪碎與否是否有助於提高萃取效率

濾紙剪碎有助於研磨,將葉綠素自浮游植物中萃取出。

(四)                     濁度的影響

以高嶺土造成的濁度在此試驗過程並不影響結果,但是會造成過濾難度提高,延長過濾時間,但不影響分析的結果,可見以高嶺土造成的濁度,濾紙將其過濾在濾紙上,經研磨、浸泡即離心後,仍大部分殘留在離心管內,不會影響到上澄液的檢測。可能是高嶺體比重較大,透過離心容易去除,對於真實樣品應多加方面測試。

(五)                     試驗過程中光照會不會造成影響

試驗結果顯示,葉綠素a對光敏感,將光照造成降解,故在進行此試驗,仍需儘可能避光。

(六)                     水樣保存與保存溫度對葉綠素a檢測的影響

美國環保署445檢測方法認為水樣應立即進行現場過濾,一般認為自然水體除了存在大量植物性浮游生物外,還有專門攝食此類植物的動物,當這些生物倍侷限在一個狹隘的器皿中,反爾造成動物不用耗費太大能量去收尋這些植物,植物因而減少。本次試驗不論是現場立即過濾、保存於4℃或25℃環境下在24小時內檢測值無明顯差異,可能是本次所取用的湖泊水,浮游植物量遠高於動物量,以至於在24小時內無明顯保存上的差異。

(七)                     萃取時間對葉綠素a檢測的影響

萃取前美國環保署445方法建議應浸泡2小時以上,但不超過24小時,而且應在4℃環境下浸泡,本試驗萃取後經0分鐘、1、2、4、16小時及3天均無明顯變化,可能是本次採取的水體單純據特株細胞壁的藻體,在萃取過程結果一致,但萃取液可保存3天而無變化,可能是冰箱開關次數不多、離心管瓶蓋鎖緊等因素。

(八)                     保存時間與方式對葉綠素a檢測的影響

樣品過濾完後,濾紙分別保存於四個不同的環境下,25℃、4℃、-20℃及-196℃環境,於保存時間2小時、4小時、1、3、7天後分別進行分析,於-196℃環境下檢測數據無明顯變化,而經過-196℃環境保存均較立即分析結果數值來的高,保存於25℃、4℃與-20℃環境下的檢測數值,隨著保存時間增長反有增加的趨勢。於-196℃環境下檢測數據可能藻體經-196℃急速冷凍下,造成藻體瞬間遭後破壞,有助於稍後的研磨萃取,而-20℃環境冷凍效果並不如-196℃劇烈與快速,影響效果為漸進式。25℃與4℃對藻體細胞萃取效率應無顯著影響,變化也不大,可能為時間久細胞逐漸造原先瓦解易碎。

六、參考資料

(一)                  Holm-Hanse, O,. Lorenzen, C. J., Holmes, R. W., Strickland, J. D. H. 1988. Coccoid eukaryotic marine ultraplankers with four different HPLC Pigment signatures. L. Phycol. 24:571-580.

(二)                  Jeffrey S. W., RF.C. Mantoura and S. W. Wright 1995. Phytoplankton pigments in oceanography:guidelines to modern methods. UNECSCO Monographs on Oceanographic Methodology, Paris, 661 pp.

(三)                                    Jeffrey, S. W., Humphrey, G. F.1975. New spectrophotometric equations for determining chlorophylls a, b, c1 and c2in higher plants, algae and natural phytoplankton. Biochem. Physiol. Pflanzen, 167: 191-194.

(四)                  Lorenzen, C. J. 1967. Determination of chlorophyll and pheopigments: spectrophotometric equations. Limnol. Oceanogr. 12:343-346.

(五)                  Parsons, T. R., Strickland, J.D.H.1963. Discussion of      spectrophotometric determination of marine plant pigments, with revised equations for ascertaining chlorophylls and carotenoids. J. Mar. Res.21:155-163.

(六)                  Satory, D. P., Grobblelaar, J.U. 1984. Extration of chlorophyll a from freshwater phytoplankton for spectorphotometric analysis. Hydrobiologia,114:177-187.

(七)                  Strickland, J. D. H. 1968. Continuous measurement of in vivo chlorophyll: a precautionary mote. Deep-Sea Res. 15:225-227.

(八)                  UNESCO 1966. Determinaton of photosynthetic pigments in seawater. UNESCO Monographs on Oceanographic Methodology, Paris, 69 pp.

(九)                  Vernon, L. P. 1960. Spectrophotometric determination of chlorophyll b and pheophytins in plant extracts. Anal. Chem. 32:1144-1150.


圖解圖示

圖一、葉綠素的家族 上為葉綠素a 、下為葉綠素b

圖解圖示

 


圖解圖示 圖解圖示

圖二、葉綠素的家族 上為葉綠素C1、下為葉綠素C2


圖解圖示


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