定量聚合酵素連鎖反應應用於微囊藻檢測

微囊藻普遍存在淡水水域中，一旦過度增生，部份微囊藻產生危害肝臟的微囊藻毒素，危及飲水安全。1996年巴西發生洗腎中心誤用含微囊藻毒的水造成人員死亡外，陸續亦報載藻華水域中游泳或水上活動而導致嘔吐、皮膚過敏等病症，明尼蘇達污染控制局（Minnesota pollution control agency）甚至警告民眾不要讓小孩與寵物接觸藻華的水域。

隨著地球暖化，水體富營養鹽，加上溫室效應，國內外專家預言藻華情形將更形嚴重，鑒於國內水庫普遍含有微囊藻卻無法由顯微鏡直接鑑別產毒株，環保署檢驗所嘗試建立以分子生物技術-定量聚合酵素連鎖反應檢測微囊藻個數，定期監測國內水庫微囊藻個數變化，並由產毒基因量來推估飲水風險。

定量聚合酵素連鎖反應（Real time polymerase chain reaction, PCR），將萃取的生物體去氧核糖核酸 (DNA) 樣品，經高溫將其變性 (denaturation)，使互補的兩股DNA分開；再用一對含20~30個核苷酸的引子結合於分開的DNA特定位置上(annealing黏合階段)，最後由高溫聚合酵素複製該對引子所涵蓋的那段DNA序列(extension擴展階段)，如此就完成PCR一個循環。週而復始，該段DNA以2的指數級數方式增加，於短時間內大量複製某一段特定DNA序列。其定量方式是藉由螢光信號與產物的複製數(模板數)成一對應關係，檢測螢光的信號就可以對PCR的產物定量，隨時監測每個循環螢光的強度，配合Ct值(Cycle threshold)進行分析可以推測起始原產物DNA的量。

隨著微囊藻基因解密，控制產毒所需10個相關酵素，約6萬多個核苷酸已完全解開。環保署檢驗所與台大漁科所共同開發mcyD基因段推估產毒藻株量，在方法驗證過程中，國內單離的12株(8株產毒，4株不產毒)及購自法國巴斯德藍綠藻收集培養中心(Pasteur culture collection of cyanobacteria)3株(2株產毒，1株不產毒)共15株微囊藻，定量聚合酵素連鎖反應檢測mcyD基因段，完全達到區隔產毒特性與計數功能，添加試驗(產毒株加入不產毒株)或遮蔽效應(加入其他藻種)測試，回收率均落於80 至120%之間，偵測靈敏度達每毫升10個，適合應用於大量野外調查微囊藻族群變化之用。環保署檢驗所將此方法應用在調查國內58座飲用水源水庫微囊藻分布情形，95年因雨水豐沛，島內並無發現微囊藻華現象，而經自來水廠處理過之清水均無發現微囊藻，國人飲用處理過後之自來水含有微囊藻毒風險值趨近零。

定量聚合酵素連鎖反應檢測快速、低交互污染、高再現性、高敏感性與特一性且具有定量功能等優點，突破傳統顯微鏡觀察法著重觀察藻株的型態、群聚型式等特質，需具備專業鑑定能力、費時、無法同時處理大量樣品、無法直接區分出是否為產毒藻種的瓶頸，將成為環境調查研究一大利器。不過定量聚合連鎖反應也有其缺點，一為檢測時萃取所得DNA，檢測過程以2的指數級增加，一但發生污染或萃取不當，所得結果可能有數百萬的差異，如作為環境法規標準仍需多加測試；二為世界衛生組織及其他國家紛紛制訂預警標準，但其累積之資料均為鏡檢結果，定量聚合連鎖反應的結果無法直接套用；三為各國學者陸續開發適合其國內微囊藻的基因段，各自強調其優點與準確性，本研究曾嘗試套用國外提供之基因段進行測試，仍不如環保署檢驗所自行開發之mcyD專一，因此基因段的選擇有區域性的限制。

 
定量聚合連鎖反應檢測不同單離藻株之產毒基因段mcyD圖

（資料來源：環保署檢驗所第五組）
（圖片來源：環保署全球資訊網）