水中大腸桿菌群檢測方法－濾膜法

中華民國96年11月29日環署檢字第0960091685A號公告
自中華民國97年3月15日起實施
NIEA E202.53B

一、方法概要

　　本方法係用濾膜檢測水中好氧或兼性厭氧、革蘭氏染色陰性、不產芽孢之大腸桿菌群（Coliform group）細菌。該群細菌在含有乳糖的 Endo 培養基上，於 35 ± 1 ℃ 培養 24 ± 2 小時會產生紅色色系具金屬光澤菌落。所有缺乏金屬光澤的菌落，均判定為非大腸桿菌群。

二、適用範圍

　　本方法適用於地面水體、地下水體、廢水、污水及海域水質及水源水質水樣中大腸桿菌群之檢測。

三、干擾

（一）水樣中含有抑制或促進大腸桿菌群細菌生長之物質。

（二）檢測使用的玻璃器皿及設備含有抑制或促進大腸桿菌群細菌生長的物質。

（三）濁度過高之水樣易造成濾膜孔隙阻塞，或造成細菌菌落瀰漫生長（spreading）而影響水樣檢驗的觀察及結果的判讀。

四、設備

（一）量筒：100 至 1000 mL 之量筒。

（二）吸管：有 0.1 mL 刻度之 10 mL 之無菌玻璃吸管或無菌塑膠製吸管，或無菌微量吸管（micropipet）。

（三）稀釋瓶：100 至 1000 mL 可滅菌、具螺旋蓋之硼矽玻璃製品。

（四）錐形瓶：200 至 1000 mL 可滅菌之硼矽玻璃製品。

（五）採樣容器：容量 100 mL 以上無菌之硼矽玻璃或塑膠製有蓋容器，使用市售無菌袋亦可。

（六）培養皿：硼矽玻璃製或可拋棄式塑膠製培養皿，大小為 60 × 15 mm、50 × 12 mm 或其他適當大小。

（七）過濾裝置：能耐高溫高壓滅菌的玻璃、塑膠、陶瓷或不鏽鋼等材質構成之無縫隙漏斗，以鎖定裝置、磁力或重力固定於底部。

（八）抽氣幫浦：水壓式或吸氣式，壓力差最好在 138 至 207 kPa 者。

（九）濾膜：使用材質為混合纖維素酯（mixed cellulose esters），直徑 47 mm 、孔徑 0.45 μm 且有格子記號的無菌濾膜。

（十）鑷子：前端平滑、內側無波紋，使用前浸泡於 95 % 酒精再以火燄燃燒滅菌。

（十一）培養箱：溫度能保持 35 ± 1 ℃ 者。

（十二）加熱板：可調溫度，並附磁石攪拌功能。

（十三）天平：待測物重量大於 2 g 時，須能精秤至 0.01 g；待測物重量不大於 2 g 時，須能精秤至 0.001 g。

（十四）高壓滅菌釜：溫度能保持在 121 ℃（壓力約 15 lb / in² 或 1.1 kg / cm²）滅菌 15 分鐘以上。

（十五）高溫乾熱烘箱：如用於玻璃器皿等用具之滅菌，溫度須能保持在 160 ℃ 達 2 小時或 170 ℃ 達 1 小時以上。

（十六）水浴槽：溫度能保持在約 50 ℃ 者。

（十七）冰箱：溫度能保持在 4 ± 2 ℃。

（十八）無菌操作檯：正壓式無菌操作檯或垂直循環負壓式無菌操作檯（Class Ⅱ 生物安全櫃）。

（十九）pH 計：pH 計之精確度必須達到 0.1 pH 單位。用於內含瓊脂培養基之 pH 值測定時，應搭配表面電極（surface probe）。

五、試劑

（一）試劑水：蒸餾水或去離子水，導電度在 25 ℃ 時小於 2 μmho / cm（μS / cm）。

（二）培養基，應使用市售商品化培養基。

1.LES Endo agar 培養基（又名 m - Endo agar LES 培養基）

每一公升之 LES Endo agar 培養基含下列成份：

酵母抽出物（Yeast extract）　　　　　　　　 　　　1.2 g

胰化酪蛋白腖（Casitone 或 Trypticase）　　　　　　3.7 g

胰化蛋白腖（Tryptose）　　　　　　　　　　　　　7.5 g

硫化蛋白腖（Thiopeptone 或 Thiotone）　　　　　 　3.7 g

乳糖（Lactose）　　　　　　　　　　　　　　　 　9.4 g

磷酸氫二鉀（K₂HPO₄）　　　　　　　　　　　　　3.3 g

磷酸二氫鉀（KH₂PO₄）　　　　　　　　　　　　 　1.0 g

氯化鈉（NaCl）　　　　　　　　　　　　　　　　3.7 g

去氧膽酸鈉（Sodium desoxycholate）　　　　　　　0.1 g

硫酸月桂酸鈉（Sodium lauryl sulfate）　　　　　 　0.05 g

亞硫酸鈉（Na₂SO₃）　　　　　　　　　　　　　 　1.6 g

鹼性洋紅（Basic fuchsin）　　　　　　　　　　　 　0.8 g

瓊脂（Agar）　　　　　　　　　　　　　　　　　15.0 g

　　將 51 g m - Endo agar LES 培養基粉末置於無菌錐形瓶，加入內含 20 mL 酒精（95 %，v / v）之 1 公升試劑水，煮沸溶解後（註：此培養基不可高溫高壓滅菌），冷卻至 45 至 50 ℃，分裝約 5 mL 之培養基至培養皿中（厚度約 3 至 5 mm），置於室溫下凝固後，避光保存於4 ± 2 ℃，保存期限為 14 天。可根據檢測需求量，依配方比例配製培養基。

2.m - Endo broth 培養基

每一公升之 m - Endo broth 培養基含下列成分：

酵母抽出物（Yeast extract）　　　　　　　　　　　1.5 g

胰化蛋白腖（Tryptose 或 Polypeptone）　　　　　　10.0 g

硫化蛋白腖（Thiopeptone 或 Thiotone）　　　　　　5.0 g

胰化酪蛋白腖（Casitone 或 Trypticase）　　　 　　　5.0 g

乳糖（Lactose）　　　　　　　　　　　　　　　　12.5 g

氯化鈉（NaCl）　　　　　　　　　　　　　　　 　5.0 g

磷酸氫二鉀（K₂HPO₄）　　　　　　　　　　　　　4.375 g

磷酸二氫鉀（KH₂PO₄）　　　　　　　　　　　　　1.375 g

硫酸月桂酸鈉（Sodium lauryl sulfate）　　　　　　　0.05 g

去氧膽酸鈉（Sodium desoxycholate）　　　　　　　 0.1 g

亞硫酸鈉（Na₂SO₃）　　　　　　　　　　　　　　2.1 g

鹼性洋紅（Basic fuchsin）　　　　　　　　　　　　1.05 g

　　將48 g m - Endo broth 培養基粉末置於無菌錐形瓶，加入內含 20 mL 酒精（95 %，v / v）之 1 L 試劑水，煮沸後（註：此培養基不可高溫高壓高壓滅菌）冷卻，分裝約 1.8 至 2.2 mL 培養液至含無菌吸收襯墊之培養皿中。未分裝之培養液應避光保存於4 ± 2 ℃，保存期限為 96 小時。可根據檢測需求量，依配方比例配製培養基。

（三）無菌稀釋液

1.磷酸二氫鉀儲備溶液

　　取 3.4 g 磷酸二氫鉀（KH₂PO₄）溶於 50 mL 的試劑水中，俟完全溶解後，以 1.0 N NaOH 溶液調整其 pH 值為 7.2 ± 0.1，然後加試劑水至全量為 100 mL，滅菌（過濾滅菌或 121 ℃ 高溫高壓滅菌 15 分鐘）後，儲存於冰箱中備用。4 ± 2 ℃下保存期限為 3 個月。

2.氯化鎂儲備溶液

　　取 8.1 g 氯化鎂（MgCl₂•6H₂O）先溶於少量試劑水，俟完全溶解後，再加試劑水至全量為 100 mL，滅菌（過濾滅菌或 121 ℃ 高溫高壓滅菌 15 分鐘）後，儲存於冰箱中備用。4 ± 2 ℃下保存期限為 3 個月。

3.無菌稀釋液

　　分別取 10 mL 氯化鎂儲備溶液和 2.5 mL 磷酸二氫鉀儲備溶液，再加入試劑水至全量為 2000 mL，混搖均勻後，分裝於稀釋瓶中，經 121 ℃ 滅菌 15 分鐘，作為無菌稀釋液備用。如欲用於水樣稀釋，分裝之無菌稀釋液滅菌後體積須為 90 ± 2.0 mL。4 ± 2 ℃ 下保存期限為 3 個月。

六、採樣與保存

（一）採微生物檢測之水樣時，應使用清潔並經滅菌之玻璃或塑膠容器或市售無菌採樣袋，且於採樣時應避免受到污染。水樣若含有餘氯時，無菌容器中應加入適量之硫代硫酸鈉（採取加氯之廢水時，每 100 mL 之水樣如加入 0.1 mL 之 10 % 硫代硫酸鈉，可中和之餘氯量約為 15 mg/L。採取含氯之飲用水水樣時，每 100 mL 之水樣如加入 0.1 mL之 3 % 硫代硫酸鈉，可中和之餘氯量約為 5 mg/L）。

（二）採樣前應清潔手部，再行採水樣，所採水樣應具有代表性。

（三）運送時水樣溫度應維持在小於 10 ℃ 且不得凍結，而實驗室內保存溫度應維持在 4 ± 2 ℃。

（四）水樣應於採樣後24小時內完成水樣過濾步驟（七、步驟（五））並置入培養箱中培養。

（五）水樣量以能做完所需檢測為度，但不得少於 100 mL。

七、步驟

（一）水樣在進行檢測或稀釋之前必須劇烈搖晃 25 次以上，以使樣品充分混搖均勻。

（二）視水樣中微生物可能濃度範圍進行水樣稀釋步驟。使用無菌吸管吸取 10 mL 之水樣至 90 mL 之無菌稀釋液中，形成 10 倍稀釋度之水樣，混合均勻。而後自 10 倍稀釋度水樣，以相同操作方式進行一系列適當之 100、1,000、10,000 倍等稀釋水樣，並混搖均勻。進行稀釋步驟時，均需更換無菌吸管。水樣稀釋步驟如附圖所示（註 1）。

（三）以無菌鑷子夾起無菌濾膜，放在無菌過濾裝置之有孔平板上，小心將漏斗固定，將過濾裝置接上抽氣幫浦。加入適量無菌稀釋液，以測定過濾設備是否裝置妥當。

（四）以無菌吸管吸取 10 mL 的原液及（或）各稀釋度水樣至無菌過濾器中過濾。過濾後，再以 20 至 30 mL 之無菌稀釋液沖洗漏斗；原液及（或）各稀釋度水樣皆需進行二重複。

（五）沖洗過濾後，解開真空裝置，將漏斗移開。儘速以無菌鑷子取出過濾後之濾膜置於培養基上，濾膜應完全與培養基貼合，避免產生氣泡。

（六）將培養皿倒置於 35 ± 1 ℃ 培養箱內培養 24 ± 2 小時。

（七）若欲進行另一個水樣時，應更換無菌過濾器（漏斗），亦可將過濾器（漏斗）以火烤後降至接近室溫重複使用。

（八）計數各稀釋度培養皿中所產生的金屬光澤菌落，並記錄之。若濾膜上金屬光澤菌落與雜菌菌落之總數超過 200 個，或是細菌瀰漫生長造成判讀困難，則以「菌落太多無法計數」（Too numerous to count；TNTC）表示，代表此一培養皿無法進行大腸桿菌群定量。

八、結果處理（計算實例請參照附表）

（一）以含 20 至 80 個菌落之同一稀釋度的兩個培養皿計算其菌落數，以 菌落數（CFU）/ 100 mL 表示之。計算公式如下：

註：X、Y：D 稀釋度之兩個培養皿的紅色金屬光澤菌落數

　　D：菌落數在 20 至 80 個之間的稀釋度

（二）培養皿之菌落數不在 20 至 80 個菌落之間時，則依菌落數實際數目以下列方式處理：

1.若原液及各稀釋水樣中僅有一個稀釋度的一個培養皿菌落數在 20 至 80 個之間，則以上述公式計算之。

2.若原液培養皿中均無菌落生長，則菌落數以小於 10（＜ 10）表示；若僅原液有菌落產生且少於 20 個，亦應計數菌落數。

3.若各培養皿之菌落數均不在 20 至 80 個之間，則選取最接近80個菌落數之同一稀釋度的兩個培養皿以上述公式計算。

（三）數據表示：若計算所得之菌落數小於 10，以「＜10」表示；菌落數小於 100 時，以整數表示（小數位數四捨五入），菌落數大於 100 以上時，只取兩位有效數字，例如菌落數為 142 時以 1.4 × 10² 表示之，菌落數 155 時以 1.6 × 10² 表示之，菌落數為 18900 時以 1.9 × 10⁴ 表示。

（四）檢測紀錄須註明採樣時間、培養起始及終了時間、培養基名稱、培養溫度及各稀釋度的原始數據等相關資料。

九、品質管制

（一）微生物採樣人員及檢測人員應具備微生物基本訓練及知識。

（二）每批次採樣時應進行運送空白。

（三）每批次或每十個水樣需進行一次試劑空白。

（四）用於結果計算之二重複數據，其對數差異值不可超出精密度管制參考範圍（計算方式參考「環境微生物檢測通則 — 細菌（NIEA E101）」），除非二重複之菌落數均小於 20。

（五）新購入之培養基，每批號均須以大腸桿菌群陽性控制菌株（如E. coli、Enterobacter aerogenes、Citrobacter freundii）進行測試，以確保數據品質。

（六）若一季期間水樣均未檢出大腸桿菌群，則須以大腸桿菌群菌株進行培養基測試，以確保數據品質。

（七）本方法培養所得之細菌可能具有感染性，檢測後之培養基及器皿應經高溫高壓滅菌處理。

十、精密度與準確度

　　略

十一、參考文獻

（一）APHA. 2005. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21st Edition, Section 9222B. American Public Health Association, Washington, D.C.

（二）Difco & BBL Manual: Manual of Microbiological Culture Media. 2003. BD Diagnostic Systems.

註 1：水樣如須稀釋，建議於稀釋後 30 分鐘內完成檢測步驟，以免造成細菌死亡或增生，影響實驗結果。

圖一　水樣稀釋步驟

表一、大腸桿菌群計算實例說明

註： TNTC 表示菌落太多，計數困難

　　畫底線數字表示用於計數